Il Tomato brown rugose fruit virus in Sicilia;la nuova emergenza fitosanitaria del pomodoro.
Tesi sperimentale a cura di :Francesca Ardu

Il pomodoro (Solanum lycopersicumL.), appartiene alla grande famiglia delle Solanaceae, oltre ad essere una delle specie orticole più diffuse al mondo, riveste una notevole importanza economico a livello mondiale.
Allo stato attuale la produzione mondiale di pomodoro si attesta intorno a 180 milioni di tonnellate coltivato su circa 4,8 milioni di ettari : Spagna e Italia hanno da tempo perduto il primato della sua produzione e sono state
superate da Cina, Stati Uniti e Turchia (FAOSTAT, 2017).

Tra i fattori limitanti la produttività del pomodoro le malattie virali, causano enormi perdite qualitative e quantitative, che si traducono in danni diretti e indiretti gravanti nella pomodoricoltura.
La continua ricerca di resistenza genetica ai principali patogeni virus e virus-simili e di nuove varietà da parte delle ditte sementiere crea una pressione selettiva anche sui patogeni di tale coltura.

La recente emergenza fitosanitaria del ToBRFV (Tomato brown rugose fruit virus) dimostra tale affermazione. L’impatto economico di questi patogeni, inteso come costi diretti ed indiretti determinati dallo stesso,                 è contrastato sia tramite pratiche agronomiche che tramite interventi legislativi che, proprio per questo
gruppo di patogeni , risultano determinanti se ben ideati su basi di conoscenze scientifiche dei patosistemi.

La recente epidemia del virus in Sicilia, preceduta e seguita da numerose altre segnalazioni del virus in vari paesi, ha creato molto allarme ma l’intervento rapido della comunità scientifica insieme ai Servizi Fitosanitari, ha buone possibilità di permettere il contenimento.
Scopo della tesi sperimentale di laurea è stato quello di monitorare la reale presenza del virus in alcuni siti di produzione del pomodoro e di accertare la possibilità di introduzione tramite semi in Sicilia.

La scelta del metodo di campionamento e diagnosi più efficiente, di concerto con i SFR, ha, inoltre, mirato ad avviare le attività per la messa a punto di un protocollo validato nonché dare indicazioni per la categorizzazione
(quarantena) del patogeno.

ToBRFV è un tobamovirus con un genoma a filamento singolo di RNA di 6.392 nucleotidi. 
Il primo focolaio di ToBRFV è stato segnalato nel 2015 in Giordania da Salem e collaboratori (2016) su pomodoro in serra. Salem e collaboratori indicano ToBRFV come un nuovo Tobamovirus e proponendo il nome
di “tomato brown rugose fruit virus”. Successivi studi e approfondimenti scientifici hanno permesso di confrontare il genoma di ToBRFV con i differenti Tobamovirus, si è notato che il ToBRFV è il risultato di una
ricombinazione genetica che lo identifica come parente lontano del Tomato mottlemosaic virus (ToMMV) ma come potenziale “parente” vicino del Tobaccomosaicvirus (TMV) (Salem et al.,2016).

Luria e collaboratori (2017) dimostrano che ToBRFV è una variante di Tobamovirus selezionatosi grazie
alla sua capacità di superare la resistenza del gene di resistenza TM-2 2 presente nelle piante di pomodoro per resistere ai Tobamovirus tramite blocco della capacità di movimento del virus all’interno dell’ospite.

Il ToBRFV è un tobamovirus con un genoma a filamento singolo di RNA

Trasmissione
Il ToBRFV ,come i Tobamovirus si trasmette per seme, via vegetativa (talee, innesto) e per contatto. La trasmissione per seme avviene per la contaminazione dei tegumenti e trasmissione meccanica (microlesioni)
all’apice vegetativo della plantula durante il germogliamento. La percentuale ancora non è nota (stima dalle prime analisi intorno al 0,29%) ma anche se bassa essa determina la presenza di piantine infette all’interno del semenzale, e successivamente al trapianto nella serra di coltivazione determinando in seguito la diffusione
rapida del virus attraverso le operazioni colturali, con gli strumenti, indumenti contaminati, mani dell’operatore e tramite contatto diretto tra le piante.

I Tobamovirus possono rimanere infettivi per un periodo lungo (anni) nei semi e per diversi mesi nei residui vegetali e sulle superficie di attrezzi e di strutture venute a contatto con succo infetto,con rischio per la coltura successiva (Wilstermann J. et al., 2019). Il virus può diffondersi a lunga distanza attraverso il commercio di materiale infetto come semi o piantine infette, motivo per cui, il virus è stato segnalato in diversi Paesi nel Gennaio 2019 ed è stato inserito nell’Alert Listdell’EPPO (European and Mediterranean-PlantProtection Organization).

Diagnosi e campionamento
Il recente allarme creato dalla rapida introduzione e diffusione del ToBRFV in diverse parti del mondo, ha trovato gli operatori del settore produttivo e gli organi competenti nella gestione fitosanitaria non preparati ad
una tale emergenza, non solo a livello europeo, ma Internazionale.
È stato,quindi, necessario adottare metodi di campionamento e di diagnosi già impiegati per altre virosi, fino in attesa di un protocollo ufficiale validato per il ToBRFV. L’unico protocollo ufficiale oggi noto è quello
dell’International Seed Federation (ISF) attualmente impiegato per la rilevazione del virus di ToBRFV in semi di pomodoro e di peperone (ISF, 2019).
Il virus, per le sue caratteristiche di trasmissione tramite seme ( contaminazione dei tegumenti) e contatto, è a rischio di rapida diffusione per via antropica e di elevato impatto economico su una coltura di interesse mondiale. Il rischio di introduzione e insediamento è elevato ed i Paesi in cui è stato segnalata la presenza del
virus stanno cercando di attuare misure fitosanitarie al fine di ridurne la diffusione. In generale, l’obiettivo dei PRA è decidere se gli organismi nocivi debbano essere regolamentati o meno come organismi nocivi da quarantena e proporre opzioni di gestione patogeno e i rischi della sua diffusione (CDFA,2018).

Le potenziali misure fitosanitarie per la gestione nuove introduzioni devono consistere nel controllo (test diagnostici) di seme in importazione e sorveglianza delle aree produttive.

In particolare, sul luogo di produzione è necessario:
• utilizzo di seme certificato mediante saggi diagnostici;
• utilizzo di seme proveniente da aree dichiarate “ToBRFV-free”;
• utilizzo di piantine da trapianto da vivai certificati.
Nelle aree PRA dove vi sono focolai :
• sorveglianza frequente nelle serre;
• alla comparsa di primi sintomi sospetti, isolamento della serra rispetto al corpo aziendale, campionamento e test diagnostici;
• utilizzo di indumenti monouso negli ambienti infetti e loro distruzione;
• distruzione delle piante infette (uso di inceneritori) e sanificazione della struttura serricola (pali, impianti fertirrigazione ect.) e attrezzi mediante prodotti disinfettanti virucidi ( PRA Italia 2019

È stato,quindi, necessario adottare metodi di campionamento e di diagnosi già impiegati per altre virosi

Rilevamento ToBRFV
Degli 87 campioni analizzati 21 sono risultati positivi con ampliconi di taglia attesa a Di questi campioni positivi 10 erano rappresentati da sub-campioni di seme e gli altri 11 da campioni vegetali sintomatici
(foglie e frutti). Dei 14 campioni sintomatici, 3 campioni risultati negativi sicuramente a causa dello stato di conservazione dei campioni (foglie) prima del conferimento in laboratorio. Tale conclusione è possibile
anche in considerazione delle successive analisi effettuate sul frutto dei suddetti tre campioni e risultate positive.

Identificazione di ToBRFV
Il sequenziamento diretto effettuato sui tre ampliconi ottenuti da RT-PCR (isolato Casarino, isolato Ventero, isolato Creativo) usando i primers generici ha prodotto una sequenza di 564-565 nuc che in BLAST hanno dato i seguenti valori di similarità con le altre sequenze di ToBRFV attualmente depositate in GenBank:isolato Casarino dal 98.41 a 99.80; isolato Ventero da 98.05 a 99.80; isolato Creativo da 97.70 a 99.60

Conclusioni
I risultati ottenuti nell’ambito delle attività della tesi hanno confermato la presenza del ToBRFV in Sicilia.
Alla conferma della sua presenza si deve sottolineare come, sia l’analisi dei campioni vegetali provenienti dalle zone di produzione del pomodoro in coltura protetta che quella di partite di seme in ingresso nel territorio siciliano, si evidenzia il rischio elevato di nuove introduzioni del patogeno nel territorio.
I numerosi interventi atti a divulgare i metodi di campionamento del virus in campo hanno alzato l’allerta nel territorio consentendo sia una rapida segnalazione del virus che la sua eradicazione.

Se a questo si aggiunge la recente decisione europea sull’introduzione di materiale “ToBRFV- free” si può prevedere che un tempo relativamente rapido permetterà una gestione efficiente di questa emergenza
fitosanitaria sia a livello regionale che europeo. L’unico punto di incertezza che necessità di una rapida risoluzione a livello Ministeriale e di Commissione Europea, è la definizione di un protocollo validato di diagnosi, aspetto fondamentale nella gestione e intercettazione dei patogeni con particolare riferimento a quelli virali.